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罗氏分子POCTCobas Liat 全自动核酸检测系统拆解

时间2022-08-29 11:49:52 作者:永乐棋牌平台官网 来源:永乐app安卓下载
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  IQuum公司成立于1998年,公司总部位于美国波士顿市区,是一家开发分子诊断和生物样本技术的生物技术公司。其旗下著名的Liat系统(Laboratory-in-a-tube,管中实验室),是一种新颖的生物样品检测平台,基于此平台最早开发的检测系统为Liat分析器和Liat流感A/B试剂盒。

  该公司于2014年8月6日被Roche集团以4.5亿美元收购。IQuum公司的收购就标志着罗氏正式进军分子诊断领域的POCT细分市场。

  笔者一直以来对Cobas Liat非常感兴趣。作为一个典型的微流控全自动核酸检测系统,Cobas Liat用上了Space Domain的PCR控温方式(该控温方式下,有固定的两个或三个温度区域,比如95℃和60℃,液体在两个或三个温度区域内来回流动以实现数十个PCR的温度循环。简单来说,就是以空间上的温度循环来取代传统QPCR仪上的时间上的温度循环)。因此,Cobas Liat呼吸道感染检测也实现了惊人的20分钟出结果。作为一个全提取+QPCR技术路线的微流控全自动核酸检测产品,这个检测速度可以说是吊打GeneXpert。然而,2020年伊始新冠爆发,GeneXpert销售额从2019年的10亿美元一路飙升至2021年38亿美元,却一直没有等来Cobas Liat大卖的消息。

  罗氏诊断Cobas Liat系统对Cobas SARS-CoV-2和A/B流行性感冒核酸测试的出现了假阳性。判断假阳性原因有两点:

  1. 化验管可能偶尔泄漏并在Cobas Liat分析仪中造成光路阻塞,从而导致PCR生长曲线异常。这可能会导致无效或错误的阳性结果,特别是对于B型流感检测而言。FDA补充道,如果试管确实泄漏,随后的测试可能会增加B型流感假阳性结果的可能。

  2. 反应管中异常的PCR循环可能产生异常的PCR生长曲线,从而导致假阳性。FDA表示这个问题是零星的,可能是由硬件定位,体积移动和曲线解释引起的。该问题可能对运行中的所有分析物造成误报。

  这也给大家一个教训:产品的稳定性决定一切;而对于微流控全自动核酸检测系统,微流控耗材的量产的稳定性,特别是封接的可靠性,做好可不太容易—你看看,罗氏都马失前蹄。

  但罗氏毕竟是罗氏,2021年3月15日Roche与GenMark Diagnostics(其主打产品也是微流控全自动核酸检测系统-GenMark ePlex system)共同宣布双方已就总交易价值约18亿美元现金收购事宜达成最终并购协议。

  无论结果如何,该产品的微流控设计思路还是非常值得借鉴的。因此,特把我们微流控技术团队之前梳理的该产品的剖析呈现给大家。

  Cobas®Liat®分析仪是具备创新功能的PCR分子诊断POCT平台。分析仪采用硬件按钮和触控板相结合的方式进行控制,测试管同时作为拭子的保存管,从分析仪的顶部插口放入,仅能装载一个样本。

  数据和显示:大约可以存储20,000个带有日期和时间的测试结果(根据文件大小而不同);支持HL7和POCT1-A的连接;PCR曲线显示;

  分析仪由于其小巧便携,能够适用临床、实验室以及室外场所。检测前只需要将待测样本添加至分析仪配套的测试管中,扫码后将测试管插入分析仪检测槽中。

  此外,分析仪还包含样本体积检测功能以及试剂批次识别,测试管包含内部对照,能够实时监测系统的运行过程,保证检测流程正常进行。

  甲类链球菌Group A Streptococcus (GAS)是人类常见的感染类细菌。检测性能参数指标如下:

  样本类型:咽拭子;检测时长:~15min;保存液:液态AMIES培养基;保存条件:2~8℃;

  流感病毒每年能造成5-10%的成年人和20-30%的儿童感染。测试管的检测性能如下:

  样本类型:鼻咽拭子;检测时长:20min;保存液:通用拭子保存液;保存条件:2~8℃;

  相当于cobas® Influenza A/B测试管的升级版,新增呼吸道合孢病毒Respiratory syncytialvirus(RSV),其是儿童期急性下呼吸道感染的主要原因,据统计约有60%的儿童急性下呼吸道感染由RSV病毒造成,新生儿中感染率达到80%。其测试管简化了医院的常规检测流程,具体检测性能如下:

  样本类型:鼻咽拭子;检测时长:~20min;保存液:通用拭子保存液;保存条件:2~8℃;

  Clostridiumdifficile (C. diff)是一种抗生素相关性结肠炎的直接致病菌,并且被认为是医院性腹泻的病原菌,该病菌能够人传人。测试管的检测性能如下:

  根据专利CN1767897B可知,测试管1主体由试样细管10、管构架50、管帽20、套筒90构成。试样细管10采用柔性材质,可选择的材质诸如聚丙烯、聚乙烯、聚氨酯、聚烯烃共聚物等。

  管帽20和管构架均可以使用诸如聚丙烯等材料制成,管帽20的外部有凸纹便于握持,管构架50上则贴有测试管的标签80。

  管帽可单独保存,其结构包含内部空腔22,空腔外壳的锥形结构62,顶部与外界联通的气孔26,以及连接锥形结构的样本收集头30。

  管构架50(长150mm、宽25mm)、试样细管10为一体结构,试样细管10的顶部开口外侧粘结有连接构件52,通过连接构件52和管构架50粘结。连接构件52上方包含加样口12和螺纹64,可以与管帽20配合对试样细管10进行密封。

  试样细管10被刚性构造的管构架50包裹,只露出细管的上下两侧宽面,通过插入套筒90以保护内部的试样细管,以防止运输过程中的意外损坏或暴露在光照和热源条件下。

  管帽(优选高度约30mm,直径14mm)主要作为样本处理过程中产生废液的收集场所,内部包含能够容纳废液的空腔22。通过压力将废液压入空腔22后需要排出内部的空气,因此管帽的顶部有通气孔。

  通过在空腔22内部植入一层柔性隔膜24将管帽内部空间和外部大气隔离。当压力迫使废液进入空腔22时,柔性隔膜24向上形变使空腔内部的空间延伸,至少可容纳500uL的液体。作为备选方案,柔性隔膜也可以采用密封效果较好的活塞体替代。

  试样细管10可通过注塑、挤出成型或吹塑成型,可以是多层结构(优选0.03mm~0.5mm)以适应内外层疏水性不同的功能。柔性材质要求工作温度2℃~105℃,低透气性,具有一定的弹性和良好的生物相容性。细管对透明度、润湿性、表面光洁度、表面电荷以及热弹性有一定的要求。因此对于选择的材料,可通过诸如拉单晶技术、等离子处理、加入添加剂、辐射处理、引入化学添加剂(如芥酸酰胺/油酰胺)等手段对细管的材质或材质表面进行改性。

  试样细管可以分为若干个节段16,每个阶段内储存有不同试剂,通过封口14对不同节段进行隔离。封口14两侧壁面相互粘结形成横跨试验细管整个宽度的封口区域,该封口强度是在外部1个大气压力强度下可剥离。封口14的宽度通常为1mm~3mm,最优选为1mm。

  封口14的通过外部温度受控的密封头、制动器、砧板配合进行热压密封。通过控制密封头的温度,压力和施压时间可以控制成型的封口14的尺寸以及释放所需压力。如:试样细管材质为PP时,密封头温度控制在105℃~140℃,压力保持在3~10个大气压,热封时间为1~30s之间。此外,还可以通过RF法和超声焊接进行密封。

  如图所示,试样细管节段包含110、120(包含121、125、122)、130、140、150、160、170、180、190,每个阶段对应内置有不同试剂210、220、230、240、250、260、270、280、290,每个节段的封口处有用于夹紧分离各个节段的夹具310、320、330、340、350、360、370、380、390,各个节段左侧的固定模块314、344、394等(图中未标明)用于和右侧的制动器312、322、332、342、352、362、372、382、392配合,通过制动器的向左挤压,使细管内液体突破封口14移动至相邻阶段内实现液体的运输。制动器可以调整和固定模块之间的距离,以适应不同压力或体积的液体释放。

  制动器至少包含一个加热模块,用于调节细管内液体的温度。制动器332中还包含一个磁铁,用于对细管节段130内的磁珠悬浮液进行俘集。光学检测器492对应节段190,用于检测PCR荧光信号。

  试样细管不同节段内置的试剂根据实际需求有所不同,其中包含的一个节段的壁面经过韧化处理。通过挤压使得微齿状内表面沿细管的轴线方向研磨运动,实现打乱固态试样或固态环境试样的细胞团的目的。该节段的内壁面结构如下图所示:

  过滤器216可通过将多层柔性过滤材料叠置在一起形成过滤器。过滤器最上层孔径较小适合过滤;底层孔径较大,作为顶层材料的支撑结构。过滤器自然状态下折叠,形成囊袋,且能够在压力作用下完全压扁,囊袋边缘固定在细管的管壁上。此时的细管内壁通过贴附磨砂表面的衬垫214(如下图所示),同样能够在挤压作用下研磨采样头30上的样本。

  垫板214(下图30)根据实际应用可由不同材质构成。底层采用纸层35作为基底,上方覆盖疏水纸质层34;或者过垫板作为滤装置,覆盖一层非渗透性的薄板38(薄板指定区域包含开口)、或疏水性纸层34,以达实现全血红细胞和白细胞分离的目的。

  过滤器过滤方法如下所示,通过夹紧过滤器206内上方节段的夹具300封闭与上方节段的通道,随后制动器302对包含过滤器206的节段施压,使过滤器表面的抗体204和红细胞202结合,血浆和白细胞208通过过滤器进入后续的节段中。

  第九节段190包含PCR冻干试剂,端部194永久封闭或者通过压力进行密封;

  开放第一夹具310,其他夹具关闭。制动器312挤压第一节段110以确保10uL的样本体积存在于110中,然后关闭夹具310,多余的样本进入管帽废液腔22中。

  夹具320开启,交替施压制动器312和322,使样本和第二节段中的缓冲液混合。

  夹具330打开,制动器332和322交替运动,使第二节段内的样本缓冲液和第三节段内裂解液交替移动并混合,并在50℃条件下孵育5min。

  夹具340打开,制动器342对第四节段施压,使异丙醇磁珠悬浮液与裂解后样本混合。

  随后制动器322、332与制动器312、342交替运动,是磁珠悬浮液和样本充分混合,培养5min。

  制动器332带有磁铁,能够吸附磁珠,在混合完成后,制动器332下压尽可能靠近细管节段,形成窄流道并吸附磁珠。制动器322和342交替运动,让液体两侧移动,提高磁珠的捕获效率。

  随后制动器342~312,以及夹具340~310依次开启和关闭,使废液逐步运输至废液腔22中。

  打开夹具350和制动器342,随后关闭制动器352,使清洗液1流入至第四节段当中。

  闭合夹具350,并打开夹具340,随后关闭制动器342,使液体流入磁珠所在的第三节段。上移制动器332即可以撤销磁场。

  随后332下压使磁珠重新吸附在磁铁附近,随后制动器342~312,以及夹具340~310依次开启和关闭,使废液逐步运输至废液腔22中。

  随后关闭夹具360,下压制动器352,使清洗液2进入第四节段中。随后关闭夹具350。

  制动器332、夹具340、330上移保证较窄的间隙并形成贯穿第三节段的流体通道,随后制动器342对第四节段缓慢施压,使清洗液2以层流的方式对第三节段中的捕获磁珠进行清洗。

  打开夹具370,打开制动器362,然后下压制动器372,使第七节段中的洗脱液进入第六节段。

  逐步撤销磁场,随后可进行适当搅拌混合,并加热至95℃培养2min。随后制动器332下压,使磁珠重新吸附。

  制动器372适当下压排出多余的洗脱液,保留50uL洗脱样本,随后关闭夹具370.

  打开夹具380,闭合制动器372,将洗脱样本转移至第八节段中,和UNG在37℃条件下混合5min,消解PCR污染产物。

  随后温度升高至95℃,灭活UNG酶,并变性DNA。随后打开夹具390,闭合制动器382,使处理后样本进入第九节段中,设置为60℃进行扩增。

  交替运行制动器392和382,使得反应液在第八和第九节段循环流动,分别进行变性和扩增。并通过荧光检测器492进行荧光信号采集。

  试样细管10中具有9个节段,管帽20内设置有废液腔22,且管帽包含拭子连接杆36和收集头30,可直接用于口腔、表面拭挂收集试样。

  第一节段121中包含50uL PBS缓冲液,其余节段中的试剂同2.2.1。

  对于拭子样本的洗脱过程:首先开启夹具310,其他夹具关闭,制动器322挤压使第二节段中的PBS缓冲液和蛋白酶k混合。

  拭子样本预先浸入20uL的PBS保存液中,然后搅拌悬浮试样,最后加入试样细管中10uL体积样本。

  血浆细菌检测的应用场景主要是试剂种类的差异:第二节段中储存50uL PBS缓冲液、第三节段中包含100uL裂解液、第四节段中包含500ug磁性硅石珠粒异丙醇悬浮液(吸附时间为5min)。

  血浆病毒检测的应用场景主要是试剂种类的差异:第四节段中含有硅石膜、硅石片或硅石纤维网(硅石膜吸附时间为5min),以及130uL异丙醇。第九节段中包含有RT-PCR试剂。

  为了进行病毒的分离和检测,采用50uL血浆作为样本,出了改性的核酸捕获步骤和额外的逆转录过程,其余步骤按照2.2.1示例演示的进行。

  血浆细菌检测的应用场景主要是试剂种类的差异:第二节段中储存50uL PBS缓冲液、第三节段中包含100uL裂解液、第四节段中包含10ug磁性硅石珠粒异丙醇悬浮液(吸附时间为15min)。

  提取试剂同2.2.5,扩增试剂为干燥的RT-PCR试剂,与细菌DNA提取有所不同。全血样本50uL,具体的控制原理同2.2.1。

  第三节段中包含100uL PBS缓冲液,用于控制试样的pH和稀释红细胞的浓度。

  第五节段和第六节段分别含有80uL清洗液。样本为50uL的全血,控制方法与2.2.1中类似。

  试剂类似2.2.5,除了第二节段中预置有干磁珠,以及RT-PCR扩增试剂差异。

  挂锁探针(padlockprobes)和解链曲线,除了第八节段中区分两个子节段,分别预置干性的挂锁探针、T4 DNA连接酶;干性核酸外切酶I和核酸外切酶III。第九节段中包含干性UNG酶以及适配的PCR扩增试剂。

  采用包含拭子头的管帽20,第一节段中分为两个子节段,第一子节段用于容纳拭子,第二子节段中包含80uL PBS缓冲液。

  第二节段中包含涂覆有抗孢子抗体的固体基质,能够吸附孢子,对于一般的细胞则亲和力较低。第二节段中还可以预装一定体积的气体,利于封口处的突破。

  该应用下的试样细管的第一阶段避免包含微齿能够通过挤压研磨固态样本,同时通过加热模块对第一阶段进行蛋白酶k水解。

  通过将第一节段分为两个子节段,其一用于容纳全血样本,其二预置注入凝血剂或干性多价抗红细胞抗体。第二子节段中还可以包含滤袋,孔径1um~10um,用于过滤血细胞,仅允许血浆通过。

  为了溶解试样,对第一节段进行封闭,然后加热至95℃孵育5min,干燥血样并破坏血细胞,血浆蛋白和PCR的抑制成分能够尽可能结合到棉芯中。然后恢复至室温。随后的第二节段中的缓冲液清洗尽可能洗脱血浆蛋白和PCR抑制剂。

  将废液运送至废液腔22后,进行洗脱步骤,95℃孵育2min,提高洗脱效率。

  测试管的外部固定模块中还包含固定磁铁430,以及检测装置472。其运行逻辑同2.2.1

  过滤节段201中包含将节段分隔为两个独立区域的过滤膜205,底部包含入口206,顶部包含出口207,出入口通过夹具进行封闭。

  需要过滤时,通过压缩节段203使清洗液突破封口74,并进入过滤节段201中,并通过过滤器205,并突破后续封口74,进入节段202执行后续的处理。空气输入和流出的过滤结构两侧的入口和出口,过滤结构能够过滤空气中的测试组分,随后通过压缩1中的萌发溶液进行洗脱。

  该测试管同时用于检测蛋白质和核酸,在竖直段71做永久封闭,水平段封口41、42、74可通过压缩不同节段进行突破。

  测试管具有两个加样口,用于检测食物样本中的细菌霉素和细菌,具体测试管结构如下。样品在加入前优先在外部进行过滤,从而分离细菌细胞核游离毒素蛋白。

  在毒素蛋白的测试通道中,1)首先免疫磁珠和样品混合,毒素蛋白和磁珠表面特异性结合。2)随后缓冲液和DNA标记的抗体与样本混合,是的DNA标记的抗体也结合在磁珠表面的毒素蛋白表面。3)固定磁珠,并使用洗涤溶液清洗磁珠表面。4)洗涤后,使用洗脱缓冲液洗脱磁珠表面的复合物,并运输至测试管的底部进行PCR扩增检测。

  在细菌DNA测试通道中,1)样本和蛋白酶k混合,进行加热水解步骤。2)随后释放溶解缓冲液,进行样本的裂解。3)样本转移至第三节段中进行磁珠结合。4)进行一次磁珠的清洗过程。5)洗脱缓冲液释放磁珠表面的DNA。6)洗脱样本进入测试管的下端进行PCR扩增。

  检出限采用热灭活的病毒样本,取自确诊病人的鼻咽拭子保存液(原始浓度3.16E+06 TCID50/mL),高浓度样本重复10次,稀释的低浓度样本重复20次。

  电脑模拟利用NCBI和GISAID数据库对比分析测试管能够检出所有分析的双靶标设计SARS-CoV-2序列。分析过程中,低于1.44%的序列与RdRp基因存在少量错配,但该片段能够完美匹配N基因。而低于0.69%的序列与N基因存在少量错配,但完美匹配RdRp基因。其中一个序列在N基因检测集的探针结合区的5端有3个错配,这部分序列完美匹配RdRp基因,因此对评估的性能无明显影响。

  通过定位引物和探针的结合区域,对所列出的所有生物体可能发生的交叉反应进行了电脑模拟分析(NCBI和GISAID数据库),SARS-CoV-2的N和RdRp靶标序列的同源性百分比如下。

  共感染实验通过设置一个高浓度的靶标和多个低浓度的靶标,并进行梯度稀释。这些实验室为了确定高浓度靶标样本是否会对低浓度的靶标样本产生竞争性的抑制。低浓度一般定义为3×LoD,高浓度靶标对应的Ct值可以在20~24或12~16。样本进行梯度稀释直至低浓度检出率100%。拷贝数浓度通过RT-ddPCR进行测定。

  重现性研究分析了不同操作人员、研究地点、测试天数、分析器和测试管批次之间检测甲型流感/乙型流感的检测差异。3个地点各有两名操作员分别在5天内,每天测试了10人份,每人份的样本重复测试三次,共计约900个结果。测试管分为三个批次,分别采用9台仪器进行测试。测试的Influenza A和Influenza B分别包含高值阴性、中阳性、弱阳性以及阴性对照样本。

  反应性研究评估了流感毒株的时间和地理多样性的检测能力,选用毒株和检测结果如下。从结果看,所有毒株均在检测浓度下检测到。

  交叉反应评估了鼻咽拭子样本中可能存在的非流感微生物,试验测试了人基因组DNA和35中微生物,细菌和白色念珠菌测试浓度高于106CFU/mL,病毒测试浓度高于105TCID50/mL。结果来看,均没有检测到交叉反应现象。

  干扰微生物测试主要目的是研究鼻咽拭子中可能存在的非流感微生物是否会干扰弱阳性Influenza A和Influenza B样本。使用的毒株和人基因组以及对应浓度同3.4.4。Influenza A和Influenza B的弱阳性样本浓度为3x LoD。

  检测浓度下的人类基因组DNA或微生物的存在不影响甲型流感或乙型流感的检测。

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